NGS (Next Generation Sequencing, sekvenování nové generace)
Komplexní metoda umožňující paralelní sekvenování velkého množství cílových oblastí DNA. V kardiogenetice představuje základní přístup k identifikaci bodových mutací, malých indelů i vybraných strukturálních změn.

Panel vybraných genů

Cílené sekvenování předem definovaného souboru genů asociovaných s konkrétním onemocněním (např. HCM, DCM, LQTS). Vysoká hloubka pokrytí a dobrá citlivost.

WES (Whole Exome Sequencing)

Sekvenování všech kódujících oblastí genomu (exonů) s menšími přesahy do intronů. Vhodné při nejasném fenotypu nebo široké genetické heterogenitě.

WGS (Whole Genome Sequencing)Panel vybraných genů

Sekvenování celého genomu včetně regulačních oblastí. Umožňuje detekci širokého spektra variant. Zatím není hrazeno v rámci diagnostické péče, využívá se primárně pro výzkumné účely.

RNA-Seq (sekvenování transkriptomu)

Analýza RNA umožňující hodnocení exprese genů, detekci aberantního sestřihu nebo přítomnosti fúzních transkriptů. V současnosti není hrazena z diagnostické péče a využívá se převážně ve výzkumu.

Deplece rRNA – odstraňuje ribozomální RNA, čímž zvyšuje podíl relevantní mRNA.
Sekvenování mRNA (oligo-dT) – využívá poly-A vázek, ale u velmi dlouhých genů (např. TTN) může dojít k neúplné syntéze cDNA a nedostatečnému pokrytí.

Bioinformatická analýza dat získaných metodami sekvenování nové generace (NGS) v kardiogenetice představuje klíčový proces, jehož cílem je převést surová sekvenační data na klinicky interpretovatelný genetický nález u pacientů s podezřením na dědičné kardiovaskulární onemocnění.

Specifikem kardiogenetiky je vysoká genetická heterogenita, variabilní penetrance, neúplná expresivita a časté fenotypové překrývání jednotlivých onemocnění. Tyto skutečnosti kladou zvýšené nároky nejen na kvalitu bioinformatického zpracování dat, ale i na následnou klinicko-genetickou interpretaci identifikovaných variant.

1. Primární analýza (zpracování surových dat)

Primární analýza zahrnuje převod signálů generovaných sekvenátorem do sekvenačních čtení ve formátu FASTQ a jejich podrobnou kontrolu kvality. V kontextu kardiogenetiky je kladen zvláštní důraz na dostatečné a rovnoměrné pokrytí genů s vysokým klinickým významem (např. MYH7, MYBPC3, TTN, LMNA, SCN5A, KCNQ1, RYR2).

Hodnoceny jsou především:

kvalita sekvenačních čtení a Q-skóre,

délka čtení a GC obsah,

hloubka a rovnoměrnost pokrytí jednotlivých exonů a splice-site oblastí.

Technické zpracování zahrnuje:

ořez nízkokvalitních bází (trimming)

odstranění adaptorových sekvencí,

filtraci krátkých nebo nekvalitních čtení.

Cílem této fáze je minimalizace technických artefaktů, které by mohly vést k falešně negativním nálezům, zejména u genů s velkou velikostí a komplexní strukturou (např. TTN).

2. Sekundární analýza (mapování a detekce variant)

Sekundární analýza spočívá v zarovnání sekvenačních čtení na referenční lidský genom (GRCh37/hg19 nebo preferenčně GRCh38) pomocí validovaných algoritmů. Výsledkem jsou soubory SAM/BAM obsahující informace o poloze čtení, kvalitě mapování a hloubce pokrytí.

Post-procesing dat zahrnuje:

označení nebo odstranění PCR duplikátů

lokální realignment v oblastech indelů

recalibraci kvality bází

Následuje vlastní detekce variant (variant calling), která umožňuje identifikaci:

jednonukleotidových variant (SNV)

malých inzercí a delecí (indel),

kopiových změn (CNV), významných např. u genů LMNA, PKP2, DSP,

vybraných strukturálních variant v závislosti na použité metodice.

Výstupem je soubor VCF (Variant Call Format) obsahující seznam detekovaných variant spolu s technickými parametry (hloubka pokrytí, kvalita volání, alelová frekvence), které jsou nezbytné pro další klinickou interpretaci.

3. Terciální analýza (anotace a klinická interpretace v kardiogenetice)

Terciární analýza představuje zásadní krok, kdy jsou technicky detekované varianty převedeny do klinického kontextu dědičných kardiovaskulárních onemocnění. Anotace probíhá s využitím širokého spektra databází s důrazem na jejich relevanci pro kardiogenetiku.

Anotace variant typicky zahrnuje:

populační frekvence (gnomAD) s ohledem na prevalenci jednotlivých kardiomyopatií a arytmických syndromů,

typ a funkční dopad varianty (missense, nonsense, splice-site, frameshift),

in-silico predikce patogenity (SIFT, PolyPhen-2, CADD),

evoluční konzervovanost postižené oblasti,

informace o exprimaci genů v srdeční tkáni a alternativním sestřihu (zásadní zejména u genu TTN),

vazbu na známé chorobné jednotky prostřednictvím databází OMIM, ClinVar, HGMD,

využití odborných databází a doporučení ClinGen a expert panels specifických pro jednotlivé jednotky (HCM, DCM, LQTS, Brugada syndrom aj.).

Interpretace variant probíhá dle doporučení ACMG/AMP, přičemž v kardiogenetice je nezbytné aplikovat genově a onemocněním specifická kritéria (např. odlišný význam missense variant u MYH7 oproti TTN). Varianty jsou klasifikovány jako patogenní, pravděpodobně patogenní, varianty nejasného významu (VUS), pravděpodobně benigní nebo benigní.
‍
Výsledkem terciární analýzy je strukturovaný podklad pro klinickou interpretaci, která musí být vždy posuzována v kontextu fenotypu pacienta, rodinné anamnézy a HPO terminologie

Multidisciplinární spolupráce kardiologa, klinického genetika, molekulárního biologa a bioinformatika je zásadní pro stanovení finálního diagnostického závěru a následného klinického managementu.

Interpretace genetických variant identifikovaných metodami NGS představuje komplexní analytický proces, jehož cílem je stanovení klinického významu varianty na základě kombinace molekulárních, populačních, bioinformatických a klinických důkazů. Postup vychází z aktuálních mezinárodních doporučení, zejména ACMG/AMP, ClinGen a oborově specifických guidelines.

Základním rámcem interpretace je ACMG klasifikace, která umožňuje systematické, reprodukovatelné a transparentní hodnocení variant napříč laboratořemi. Varianty jsou hodnoceny a klasifikovány do pěti kategorií (patogenní – benigní) na základě kombinace předdefinovaných kritérií různé síly.

Finální interpretace genetického nálezu by měla probíhat formou multidisciplinárního hodnocení, do něhož jsou zapojeni:

• molekulární biolog

• klinický genetik

• dle potřeby kardiolog nebo další specialista

Tento přístup je zásadní pro zajištění klinicky relevantní, konzistentní a bezpečné interpretace genetických nálezů, zejména u variant s omezenou úrovní důkazů nebo variabilní penetrancí.

Geny pevně asociované s daným onemocněním tvoří základ pro klinicky relevantní genetickou diagnostiku. V přehledu jsou uvedeny geny, u nichž byl prokázán silný či průkazný vztah ke specifickým kardiologickým onemocněním (ClinGen Gene Curation Expert Panels, https://clinicalgenome.org).

Zařazeny jsou pouze geny, u nichž byla jejich role v patogenezi dané jednotky klasifikována jako průkazná nebo silná, případně spadají do skupiny základních („core“) genů pro diagnostiku daného onemocnění.

• U každého genu jsou uvedeny následující údaje:

  • klinicky relevantní onemocnění, ke kterému je gen přiřazován

  • referenční transkript používaný v klinické genetice

  • předpokládaný nebo prokázaný typ dědičnosti

  • úroveň důkazů podporujících kauzalitu

  • zařazení mezi ACMG Secondary Findings geny

V klinické genetice je každá nalezená varianta popisována standardizovaným způsobem, tak aby mohla být správně interpretována a porovnávána mezi laboratořemi i mezinárodními databázemi. Varianta je vždy označována typem změny, přesnou HGVS anotací a příslušnými databázovými identifikátory, které umožňují dohledání její frekvence v populaci, klinického hodnocení i literárních údajů.

Pro popis genetických variant je používán mezinárodní standard HGVS (Human Genome Variation Society https://hgvs-nomenclature.org/stable/recommendations/general/ ). Tento systém zajišťuje, aby byly genetické varianty zapisovány jednoznačně, reprodukovatelně a konzistentně napříč laboratořemi a databázemi.

Nedílnou součástí standardizovaného HGVS zápisu je jednoznačné určení referenční genomové sestavy, vůči níž je varianta anotována. V klinické a výzkumné praxi se nejčastěji používají tyto anotace:

• GRCh37 (hg19)

• GRCh38 (hg38)

Zápis varianty musí vždy jednoznačně uvádět, ke které referenční sestavě se vztahují genomové souřadnice, protože rozdíly mezi sestavami mohou vést k odlišné lokalizaci varianty. Tato informace je klíčová pro správnou interpretaci, porovnání s databázemi a zpětnou dohledatelnost nálezu.