NGS (Next Generation Sequencing, sekvenování nové generace)
Komplexní metoda umožňující paralelní sekvenování velkého množství cílových oblastí DNA. V kardiogenetice představuje základní přístup k identifikaci bodových mutací, malých indelů i vybraných strukturálních změn.

Panel vybraných genů

Cílené sekvenování předem definovaného souboru genů asociovaných s konkrétním onemocněním (např. HCM, DCM, LQTS). Vysoká hloubka pokrytí a dobrá citlivost.

WES (Whole Exome Sequencing)

Sekvenování všech kódujících oblastí genomu (exonů) s menšími přesahy do intronů. Vhodné při nejasném fenotypu nebo široké genetické heterogenitě.

WGS (Whole Genome Sequencing)

Sekvenování celého genomu včetně regulačních oblastí. Umožňuje detekci širokého spektra variant. Zatím není hrazeno v rámci diagnostické péče, využívá se primárně pro výzkumné účely.

RNA-Seq (sekvenování transkriptomu)

Analýza RNA umožňující hodnocení exprese genů, detekci aberantního sestřihu nebo přítomnosti fúzních transkriptů. V současnosti není hrazena z diagnostické péče a využívá se převážně ve výzkumu.

Deplece rRNA – odstraňuje ribozomální RNA, čímž zvyšuje podíl relevantní mRNA
Sekvenování mRNA (oligo-dT) – využívá poly-A konec, ale u velmi dlouhých genů (např. TTN) může dojít k neúplné syntéze cDNA a nedostatečnému pokrytí.

Bioinformatická analýza dat získaných metodami sekvenování nové generace (NGS) představuje klíčový proces, jehož cílem je převést surová sekvenační data na klinicky interpretovatelný genetický nález u pacientů s podezřením na dědičné onemocnění.

Specifikem kardiogenetiky je vysoká genetická heterogenita, variabilní penetrance, neúplná expresivita a časté fenotypové překrývání jednotlivých onemocnění. Tyto skutečnosti kladou zvýšené nároky nejen na kvalitu bioinformatického zpracování dat i na následnou klinicko-genetickou interpretaci identifikovaných variant.

1. Primární analýza (zpracování surových dat)

Primární analýza zahrnuje převod signálů generovaných sekvenátorem do sekvenačních čtení ve formátu FASTQ a jejich kontrolu kvality.
V kardiogenetice je kladen zvláštní důraz na dostatečné a rovnoměrné pokrytí genů s vysokým klinickým významem (např. MYH7, MYBPC3, TTN, LMNA, SCN5A, KCNQ1, RYR2).

Hodnoceny jsou především:

kvalita sekvenačních čtení a Q-skóre (Phred-like quality score; pravděpodobnost, že je konkrétní určená báze přečtena chybně, tzn. čím je Q skóre vyšší, tím je čtení přesnější)

délka čtení a GC obsah

hloubka a rovnoměrnost pokrytí jednotlivých exonů a splice-site oblastí

Technické zpracování zahrnuje:

ořez nízkokvalitních bází (trimming)

odstranění adaptorových sekvencí

filtraci krátkých nebo nekvalitních čtení

Cílem této fáze je minimalizace technických artefaktů, které by mohly vést k falešně negativním nálezům, zejména u genů s velkou velikostí a komplexní strukturou (např. TTN).

2. Sekundární analýza (mapování a detekce variant)

Sekundární analýza spočívá v zarovnání sekvenačních čtení na referenční lidský genom (GRCh37/hg19 nebo preferenčně GRCh38) pomocí validovaných algoritmů. Výsledkem jsou soubory SAM/BAM obsahující informace o poloze čtení, kvalitě mapování a hloubce pokrytí.

Post-procesing dat zahrnuje:

označení nebo odstranění PCR duplikátů

lokální realignment v oblastech indelů

rekalibraci kvality bází

Následuje vlastní detekce variant (variant calling), která umožňuje identifikaci:

jednonukleotidových variant (SNV)

malých insercí a delecí

kopiových změn (CNV), významných např. u genů LMNA, PKP2, DSP

vybraných strukturálních variant v závislosti na použité metodě

Výstupem je soubor VCF (Variant Call Format) obsahující seznam detekovaných variant spolu s technickými parametry (hloubka pokrytí, kvalita genotypu, alelová frekvence), které jsou nezbytné pro další klinickou interpretaci.

3. Terciální analýza (anotace a klinická interpretace v kardiogenetice)

Představuje klíčový krok, při kterém jsou detekované genetické varianty interpretovány v klinickém kontextu dědičných kardiovaskulárních onemocnění.
Anotace probíhá s využitím širokého spektra databází s důrazem na jejich relevanci pro kardiogenetiku.

Anotace variant typicky zahrnuje:

populační frekvence (gnomAD) s ohledem na prevalenci jednotlivých kardiomyopatií a arytmických syndromů

typ a funkční dopad varianty (missense, nonsense, splice-site, frameshift)

in-silico predikce patogenity (SIFT, PolyPhen-2, CADD)

evoluční konzervovanost postižené oblasti (GERP score)

informace o exprimaci genů v srdeční tkáni a alternativním sestřihu (zásadní zejména u genu TTN)

vazbu na známé chorobné jednotky prostřednictvím databází OMIM, ClinVar, HGMD

využití odborných databází a doporučení ClinGen a expertních panelů specifických pro jednotlivé jednotky (HCM, DCM, LQTS, Brugada syndrom aj.)

Interpretace variant probíhá dle doporučení ACMG/AMP, přičemž v kardiogenetice je nezbytné aplikovat genově a onemocněním specifická kritéria (např. odlišný význam missense variant u MYH7 oproti TTN). Varianty jsou klasifikovány jako patogenní, pravděpodobně patogenní, varianty nejasného významu (VUS), pravděpodobně benigní nebo benigní.
‍
Výsledkem terciární analýzy je strukturovaný podklad pro klinickou interpretaci, která musí být vždy posuzována v kontextu fenotypu pacienta, rodinné anamnézy a HPO terminologie.

Multidisciplinární spolupráce kardiologa, klinického genetika, molekulárního biologa a bioinformatika je zásadní pro stanovení finálního diagnostického závěru a následného klinického managementu.

Interpretace genetických variant identifikovaných metodami NGS představuje komplexní proces, jehož cílem je stanovení jejich klinického významu varianty na základě kombinace molekulárních, populačních, bioinformatických a klinických důkazů. Postup vychází z aktuálních mezinárodních doporučení ( ACMG/AMP, ClinGen a oborově specifických guidelines).

Základním rámcem je ACMG klasifikace, která umožňuje systematické, reprodukovatelné a transparentní hodnocení variant napříč laboratořemi. Varianty jsou klasifikovány do pěti kategorií (od patogenních po benigní) na základě kombinace předdefinovaných kritérií různé síly.

Finální interpretace genetického nálezu by měla probíhat formou multidisciplinárního hodnocení, do něhož jsou zapojeni:

• molekulární biolog

• klinický genetik

• dle potřeby kardiolog nebo další specialista

Tento přístup je zásadní pro zajištění klinicky relevantní, konzistentní a bezpečné interpretace genetických nálezů, zejména u variant s omezenou úrovní důkazů nebo variabilní penetrancí.

Geny pevně asociované s daným onemocněním tvoří základ pro klinicky relevantní genetickou diagnostiku. V přehledu jsou uvedeny geny, u nichž byl prokázán silný či průkazný vztah ke specifickým kardiologickým onemocněním (ClinGen Gene Curation Expert Panels).

Zařazeny jsou pouze geny, u nichž byla jejich role v patogenezi dané jednotky klasifikována jako průkazná nebo silná, případně spadají do skupiny základních („core“) genů pro diagnostiku daného onemocnění.

• U každého genu jsou uvedeny následující údaje:

  • klinicky relevantní onemocnění, ke kterému je gen přiřazován

  • referenční transkript používaný v klinické genetice

  • předpokládaný nebo prokázaný typ dědičnosti

  • úroveň důkazů podporujících kauzalitu

  • zařazení mezi ACMG Secondary Findings geny

V klinické genetice je každá nalezená varianta popisována standardizovaným způsobem, aby bylo možné její správnou interpretaci a srovnání mezi laboratořemi i mezinárodními databázemi.
Varianta je označována přesnou HGVS anotací, typem změny a příslušnými databázovými identifikátory, kkteré umožňují dohledat její frekvenci v populaci, klinické hodnocení i dostupné literární údaje.

Pro popis genetických variant se používá mezinárodní standard HGVS (Human Genome Variation Society). Tento systém zajišťuje jednoznačný, reprodukovatelný a konzistentní zápis variant napříč laboratořemi a databázemi.

Nedílnou součástí HGVS zápisu je jednoznačné určení referenční genomové sestavy (GRCh, Genome Reference Consortium Human), vůči níž je varianta anotována. V klinické a výzkumné praxi se nejčastěji používají tyto anotace:

• GRCh37 (hg19)

• GRCh38 (hg38)

Zápis varianty musí vždy jednoznačně uvádět  použitou referenční sestavu, protože rozdíly mezi nimi mohou vést k odlišné lokalizaci varianty. Tato informace je klíčová pro správnou interpretaci a porovnání s databázemi a zpětnou dohledatelnost nálezu.